磷酸化修饰（Phosphorylation modification），目前研究最为广泛的PTMs，是原核生物和真核生物中最重要的调控修饰形式。因其调控底物蛋白活性的特点，磷酸化修饰被称为蛋白质的功能“开关”，涉及几乎所有细胞过程中蛋白质在时间和空间尺度上的调节，如蛋白质活性、稳定性、构象、与其他生物分子的互作等，影响着包括细胞代谢、生长、分裂、分化、运动、细胞器运输、膜运输、肌肉收缩、免疫、学习和记忆等在内的每一个基本生命过程。
图1 蛋白质磷酸化的代表性功能[1]
蛋白磷酸化是指激酶催化γ-磷酸从ATP转移到蛋白质中的特定氨基酸侧链上的过程，通常会将疏水非极性蛋白质转化为亲水极性蛋白质。这一过程通常是可逆的，其反过程被称为去磷酸化。催化磷酸化修饰发生的酶被称为激酶（kinase），而去除蛋白磷酸化修饰的酶则被称为磷酸酶（phosphatase）。激酶是真核生物中最大的基因家族之一，30%的细胞蛋白在至少有一个残基上被磷酸化，这些结果足以印证蛋白发生磷酸化修饰的普遍性。研究表明，磷酸化修饰的发生存在氨基酸偏好性，最常发生在丝氨酸（Ser）上，其次是苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基，分别占86.4、11.8和1.8%。这三种均为极性氨基酸，但不带电荷，磷酸化发生在氨基酸侧链的羟基上，并带上两个负电。除此之外，激酶也可以作用于其他氨基酸的侧链，但频率较低。
图1 蛋白质磷酸化及去磷酸化过程示意图[1,2]
激酶广泛分布于细胞核、细胞质、线粒体和微粒体中。到目前为止，已经鉴定和验证了518种激酶，占人类基因组基因数量的2%。根据发生蛋白磷酸化的氨基酸类型，激酶主要分为以下三类，包括丝氨酸/苏氨酸激酶（STKs）、蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、双特异性激酶（DSKs）和组氨酸激酶（HPKs）。而根据激酶结构域的序列相似性，激酶可又分为以下几类：酪氨酸激酶（TK）家族、酪氨酸激酶样（TKL）家族、Sterile 20丝氨酸/苏氨酸（STE）激酶家族、酪激酶1（CK1）家族、蛋白A、G和C（AGC）激酶家族、CAMK家族、CMGC家族、糖原合酶激酶（GSK）和CDK样激酶、受体鸟苷酸环化酶家族（RGC）等。
相比之下，许多磷酸酶被认为是被动的管家酶，相关研究并没有激酶广泛。根据其底物特异性，磷酸酶也可以分为三个主要家族，包括磷酸蛋白磷酸酶（PPP）家族、金属依赖性蛋白磷酸酶（PPM）家族和蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族，以及另外三个家族：HADs、LPs和NUDT。根据序列及结构的保守性，蛋白磷酸酶又可分为10种类型，包括CC1、CC2、CC3、PPM、PPPL、HAD、AP、HP、PHP和RTR1。
图2 激酶和磷酸酶的分类[1]
蛋白质磷酸化相关的研究大多聚焦于激酶和底物蛋白。下面我们一起来看看关于磷酸化蛋白研究的常见策略：
1、 筛选激酶并确定酶活参与功能表征
① 通过对疾病样本进行功能高通量筛选（HCS），筛选到有功能的激酶；
② 根据表达量高低选择干扰或过表达选定的激酶进行表型验证；
③ 进行酶活突变体功能验证：将ATP/GTP结合位点突变掉（一般突变为不影响肽链构象也无法被修饰的丙氨酸），将突变型、野生型进行表达后，观察相关功能表征变化。
2、 确定激酶下游底物
① 通过敲低激酶的方式检测敲低后细胞样品中磷酸化降低的蛋白；
② 再通过激酶酶活突变体表达后的样品进行IP-MS（免疫沉淀-质谱联用技术）获得互作蛋白。
①和②两个实验中均出现的蛋白即为激酶下游的可能目标底物。
3、 进行底物的功能验证
通过文献研究及底物表达调控（过表达/干扰）验证底物功能与调控激酶后表征的相关性。
4、 底物磷酸化位点功能验证
在“确定激酶下游底物”步骤中IP-MS结果通常会提示具体的修饰位点，可以通过将这些位点进行突变以验证具体位点的磷酸化情况。磷酸化位点突变体分成两种类型，组成失活型突变和组成激活型突变。
组成失活型突变：因为丙氨酸无羟基，无法被磷酸化修饰，所以通常选择将磷酸化位点突变为丙氨酸（A），另外考虑到维持原有的蛋白结构，也有将酪氨酸突变为苯丙氨酸（F）的。
组成激活型突变体：把磷酸化位点突变为天冬氨酸（D）或者谷氨酸（E），因为这两个氨基酸天然带一个负电，可以模拟持续磷酸化状态。
由于很多转录因子的活性也受磷酸化调控，所以若底物为一种转录因子时，除了正常的功能验证还可通过融合荧光观察野生型和突变型的定位改变情况（出/入核），以及通过双荧光素酶检测实验验证磷酸化对转录因子活性的影响。
5、 激酶与底物互作验证
确定激酶及底物的功能后，还需进一步利用野生型激酶、激酶酶活突变体、野生型底物及其组成失活型突变进行CO-IP进一步验证两者之间的直接互作关系。
蛋白质磷酸化是人类最丰富的PTMs之一，参与许多生理过程的调节，在细胞增殖、转录调控、DNA修复、亚细胞定位和肿瘤发展等细胞活动中发挥重要作用。激酶的突变和异常表达导致下游信号通路的异常激活或失调，这一现象在多种人类疾病中均存在，如免疫疾病、高尿酸血症、神经退行性疾病和癌症。以激酶或下游底物作为调控靶点可以为疾病药物筛选提供大量的思路。汉恒生物可咨询磷酸化研究方案并定制靶向特定组织及细胞的基因调控（突变、KD、KO、过表达等）工具，包括慢病毒（Lentivirus, LV）、腺病毒（Adenovirus，AD）、腺相关病毒（Adeno-associated-virus,AAV）以及质粒等，如有需求，欢迎随时咨询。
参考文献：
[1] Zhong Q, Xiao X, Qiu Y, et al. Protein posttranslational modifications in health and diseases: Functions, regulatory mechanisms, and therapeutic implications. MedComm (2020). 2023;4(3):e261. Published 2023 May 2. doi:10.1002/mco2.261