轮状病毒属于呼肠弧病毒科,轮状病毒属,是引起婴幼儿及幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一。大熊猫感染轮状病毒后,常常导致患病大熊猫食欲废绝、急性呕吐、体温不高、白细胞升高、进一步发展为水样、蛋花样腹泻(夹有大量的粘液和坏死的肠粘膜)、腹部胀气、腹泻迁延为主要特征的传染性、顽固性腹泻病,最终因多器官功能衰竭死亡,给大熊猫的繁殖和健康带来了极大的危害。目前国内外对大熊猫轮状病毒的研究还很少,尚未进行系统地研究,给大熊猫轮状病毒的预防和控制带来了极大的挑战,基于以上考虑,本研究旨在获得病毒基因组,对其重要的蛋白质基因进行生物信息学分析,为病毒蛋白的抗原性和新型大熊猫轮状病毒疫苗的研制奠定基础。主要研究内容包括以下几个方面： 1大熊猫轮状病毒CH-1株基因组编码区的克隆 根据NCBI中收录的轮状病毒基因组序列设计11对引物,利用RT-PCR技术从经MA-104细胞增殖的大熊猫轮状病毒RNA中分段扩增出相应片段,经TA克隆、筛选及测序鉴定,成功构建了大熊猫轮状病毒11个基因节段的克隆重组质粒。各个序列的GenBank登录号分别为：VP1(HQ641297)、VP2(HQ641294)、VP3(HQ641295)、VP4(HQ641296)、VP6(GU188283)、VP7(GU188284)、NSP1(GU205762)、NSP2(GU188281)、NSP3(GU329525)、NSP4(GU188282)和NSP5(GU329526)。 2大熊猫轮状病毒CH-1株重要蛋白质基因的生物信息学分析 以大熊猫轮状病毒CH-1株VP4、VP6、VP7和NSP4为分析对象,应用生物信息学方法初步分析基因结构及功能,与不同动物轮状病毒并构建系统进化树。结果显示VP4包含1个2331 bp的开放阅读框(ORF),编码776个氨基酸。生物信息学分析表明,VP4蛋白基因编码产物分子量为86768.8 u,总平均亲水性为-0.265,最大疏水性为2.244,最小疏水性为-2.911,无信号肽序列；无跨膜区,其抗原决定簇主要位于N-末端和C-末端,结构分析显示其可能包含8个N-糖基化作用位点,系统进化分析显示大熊猫轮状病毒的VP4基因与猪轮状病毒的VP4基因的进化距离最近；VP6包含1个1194 bp的完整开放阅读框,编码397个氨基酸；预测大熊猫轮状病毒VP6理论相对分子质量为44 725.1 u,总平均亲水性为-0.225,疏水性介于-2.733～1.822,无信号肽序列,无跨膜区,其抗原决定簇主要位于N端；结构分析显示其可能包含5个N-糖基化位点,系统进化树分析显示大熊猫轮状病毒VP6基因与猪轮状病毒VP6基因的进化距离最近。VP7包含1个981 bp的完整开放阅读框,编码326个氨基酸；预测其蛋白理论分子量为37354.8 u,总平均亲水性为-0.015,疏水性介于-2.344～3.567,在1～24位氨基酸可能是信号肽序列,有两个跨膜区,抗原表位预测显示VP7蛋白的抗原决定簇分布于整个蛋白；结构预测显示其可能包含2个N-糖基化作用位点,系统进化树分析显示大熊猫轮状病毒VP7基因与人轮状病毒VP7基因的进化距离最近；NSP4包含1个528 bp的完整开放阅读框,编码175个氨基酸;预测大熊猫轮状病毒NSP4理论相对分子质量为20 223.7 u,总平均亲水性为-0.240,疏水性介于-2.400～2.622,无信号肽序列,有1个跨膜区,其抗原决定簇主要位于C端,结构预测显示其可能包含2个N-糖基化作用位点,系统进化树分析显示大熊猫轮状病毒NSP4基因与猪轮状病毒NSP4基因的进化距离最近。